液相色谱仪作为实验室、科研及工业检测领域的核心分析工具，其操作规范性直接影响数据准确性。本文结合仪器行业10年实操经验与新手常见误区，从开机流程、系统平衡、故障应对到关机规范，提供一套可直接套用的标准化操作指南，助你快速掌握HPLC入门技巧。

一、开机前的准备：环境检查与安全规范

在启动仪器前，需完成环境确认与耗材检查，避免因基础准备不足导致系统报错。

⓵ 环境要求：

实验室温度需控制在 20-25℃（温差过大易导致流动相脱气不完全，泵压不稳定）。

电压稳定在 220±10% V，建议配备稳压电源（电压波动会损坏检测器光源或电子元件）。

工作台水平无震动，远离强电磁干扰源（如离心机、大型仪器）。

⓶ 耗材核对：

流动相：检查浓度、纯度是否符合实验要求（如反相色谱常用 乙腈/甲醇-水溶液，等度洗脱需单一溶剂或混合溶剂现配现用）。

色谱柱：确认型号、规格（常用C18柱尺寸如4.6×250mm/5μm），新柱启用前需用初始流动相冲洗至少30分钟，避免残留溶剂导致峰形拖尾。

滤头与管路：检查溶剂入口滤头是否堵塞（白色滤网脏污需用超声清洗），管路是否有气泡（开机前若管路未排气，泵会报“Pressure Low”）。

二、开机流程：从电源到系统自检

开机需遵循 “先开辅助设备→再开主机” 逻辑，避免电压冲击损坏检测器（光电二极管阵列检测器PDA需预热30分钟以上）。

Step 1：启动前级设备

⓵ 电脑与软件：先开启工作站（如Empower、Chromeleon或变色龙软件），待软件加载完毕后，再启动仪器硬件。

⓶ 溶剂输送系统：打开溶剂瓶（如双元泵需同时开A/B泵溶剂瓶），启动脱气机（如在线真空脱气机需设定真空度-0.08~-0.1MPa，流速10mL/min）。

Step 2：主机电源与泵启动

⓵ 按下仪器电源开关：系统完成自检（约30秒），屏幕显示“Ready”状态后，进入软件界面。

⓶ 初步排气：

单泵系统：点击软件“Purge”按钮（流速5mL/min），持续2分钟，观察管路无气泡（若有气泡，可重复启动Purge，直至管路液体呈持续稳定流）。

双泵系统：先打开A泵，待A泵压力稳定（<10 bar）后再开B泵，避免双泵压力叠加导致瞬时过载。

Step 3：检测器与自动进样器开机

紫外检测器（UV）：开机后立即预热，先运行“基线校准”，使基线噪声降至 <5 μV（基线噪音高时，需检查是否有氘灯能量不足，软件显示“Lamp Warm-up”即表示正在发光管预热）。

自动进样器：点击“Home”或“Init”键，使进样针归位（归位时若无法机械回位，需手动检查轨道是否有残留样品堵塞）。

FAQ问答场景：

Q：开机后泵报错“Blocked”怎么办？A：优先检查流动相滤头（如溶剂入口滤网卡在瓶内）或单向阀（单向阀堵塞需用10%硝酸超声10分钟，再用超纯水冲洗至中性）。

三、系统平衡：从基线稳定到梯度参数设置

HPLC的核心难点在于系统平衡——流动相需在色谱柱中达到稳定分布，确保保留时间与峰形一致，这一步直接决定实验重复性。

关键平衡指标

⓵ 基线稳定：紫外检测器基线噪声需≤ ±2 μV，漂移≤ ±5 μV/h（若基线持续上升，可能是氘灯能量衰减，需更换或清洁灯窗）。

⓶ 压力稳定：等度洗脱时，泵压波动应≤ ±5 bar；梯度洗脱时（如0-10% B，流速1mL/min），压力变化需逐步过渡（泵压力上升至150-200 bar属正常范围，若骤升需排查色谱柱堵塞）。

梯度平衡技巧

初始条件设置：若方法为“等度→梯度”切换（如50%水相→90%乙腈），需先按等度平衡30分钟，再切换梯度（直接梯度启动可能导致色谱柱压力骤升，损坏固定相）。

柱温箱控制：若柱温箱未开启，需提前预热30分钟（柱温波动会导致保留时间漂移，尤其对温度敏感型固定相如氨基柱）。

四、关机规范：从梯度降低到系统保护

关机需严格遵循 “先关泵→再关检测器→最后关电脑” ，避免色谱柱因流动相中断导致固定相收缩。

Step 1：方法与数据备份

关机前务必确认“数据已保存至本地硬盘→手动备份至U盘”（HPLC软件崩溃概率低，但极端情况下需保留原始数据）。

若实验未结束，可暂停程序并导出“临时图谱”（仅含已保留峰，避免关机后重新平衡耗时）。

Step 2：流动相切换与系统冲洗

⓵ 梯度归零处理：将流动相比例调回 50%水相（若用A/B泵，设B%=50%，流速1mL/min），冲洗色谱柱 10分钟（防止梯度残留导致下次实验峰形异常）。

⓶ 更换保护柱：新柱或复杂样品后，需用纯甲醇/乙腈冲洗（高比例有机溶剂可去除残留极性物质），再切换至水相（避免固定相脱水收缩）。

Step 3：管路排空与电源关闭

⓵ 泵排空：点击“Purge”键至流速10mL/min，持续5分钟，使管路完全充满水相（若直接关泵，泵内残留溶剂会凝固，堵塞单向阀）。

⓶ 仪器关机：关闭各模块电源（按顺序：检测器→泵→自动进样器→工作站→电脑）。

注意：若实验需临时中断（如午餐休息），可暂停“泵”但保持“检测器+柱温箱”运行（柱温箱需维持25℃，避免反复启停导致色谱柱性能衰减）。

五、高级进阶：新手常见故障速查手册

总结

掌握HPLC操作的核心是 “标准化流程+问题预判”：开机前环境检查（10分钟）、系统平衡（30分钟）、关机前冲洗（15分钟），这些看似重复的动作，实则是保障数据可靠性的关键。建议新手每操作一次，用手机拍摄流程照片并标注关键参数（如压力曲线、基线噪音值），形成个人“操作日志”，逐步提升实验稳定性。