1.实验目的

细胞凋亡时会发生一系列形态学特征的变化，质膜的改变是凋亡早期的特征之一，例如质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（ phosphatidylserine，PS）重新分布，由胞膜内侧翻转到胞膜外侧， 暴露于细胞外表面。

Annexin-V是一种的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能够与细胞凋亡过程翻转到膜外的 PS 高亲和力特异性的结合，在 Annexin-V上链接一种荧光染料（如FITC），就可以通过流式监测到早期凋亡的发生。

PI（Propidium iodide）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而凋亡中晚期的细胞和死细胞细胞膜破损， PI 能够透过而使细胞核染色。将 Annexin-V 和PI 联合使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。

2.实验步骤

a）  400g离心5min沉淀细胞，弃上清，加入2mL PBS洗涤一次；

b）  400g离心5min, 弃上清，1mL PBS重悬细胞，取1根流式管做好标记；

c）  分别加入 Annexin-V-FITC、PI-PE ，100uLBinding buffer ，避光孵育15-20min，上机检测。

3.结果解读

①活细胞：Annexin V-/PI-；细胞膜完整，不结合Annexin V，PI也不能进入细胞，因此两者都不会发出荧光信号。

②早期凋亡细胞：Annexin V+/PI-；细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，Annexin V可以结合，但由于细胞膜仍然完整，PI不能进入，只有Annexin V发出荧光信号。

③晚期凋亡细胞：Annexin V+/PI+；细胞膜完整性受损，Annexin V和PI都可以进入细胞，两者都会发出荧光信号

④坏死细胞：Annexin V-/PI+；与晚期凋亡细胞类似，但由于是坏死过程，细胞通常会有更明显的细胞膜破裂和内容物泄漏。