一、实验背景与原理

RNA甲基化修饰是表观转录调控的重要形式，其中N6-甲基腺苷（m6A）是最常见且研究最深入的RNA修饰类型之一。m6A修饰广泛存在于真核生物mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）中，与RNA的稳定性、剪接、翻译效率及降解过程均具有重要影响。

本实验采用 Bio.ruqi RNA甲基化免疫共沉淀试剂盒（MeRIP Kit，货号RQM008-01/02/03），利用m6A特异性抗体结合并富集具有m6A修饰的RNA片段。该方法结合Trizol提取、RNA片段化、免疫共沉淀、Protein A/G磁珠结合与qPCR定量检测，可系统评估目标RNA的甲基化修饰水平。

实验基于免疫共沉淀原理：将随机打断的RNA与m6A抗体反应形成免疫复合物，再通过Protein A/G磁珠捕获沉淀带有甲基化修饰的RNA片段，随后回收RNA并反转录为cDNA，用于qPCR检测或后续测序分析。

二、实验材料

主要试剂：PMSF（Genstar，B111-01）、磷酸酶抑制剂（Selleck，B15001）、蛋白酶抑制剂（Selleck，B14001）、反转录试剂盒（TAKARA，RR037A）、Anti-N6-methyladenosine (m6A) 抗体（Abcam，ab208577）、RNA甲基化免疫共沉淀试剂盒（Bio.ruqi，RQM008-01/02/03）、qPCR mix（Yeasen，11202ES03）。

主要仪器：高速冷冻离心机（湘仪 TGL-16）、PCR仪（BIO-RAD PTC-100）、磁力架（Thermo DynaMag™-2）、荧光定量PCR仪（Thermo Fisher ViiA7）、垂直混匀器（Kylin-Bell BE-1100）。

三、实验步骤

（一）RNA提取：收集1×10⁷个293T细胞，用预冷PBS漂洗两次，1000 rpm离心5 min去除上清。加入1 mL Trizol裂解细胞，吹打均匀后室温静置5 min。每1 mL Trizol加入200μL氯仿，剧烈震荡15 s后室温放置3 min。以12000 g、4℃离心15 min后，取上层水相约500μL转入新管，加入等体积异丙醇沉淀RNA。以75%乙醇洗涤两次，晾干后溶于RNase-free水，-80℃保存。

（二）RNA片段化：取10μL RNA（总量≥10μg）加入等体积Frag Buffer，94℃孵育6–7 min，冰浴终止反应。使用酚氯仿抽提RNA并配制1%琼脂糖凝胶检测片段长度（约100–300 nt）。取2μL RNA作为Input样本，其余分为m6A组与IgG组。

（三）免疫共沉淀：m6A组与IgG对照组分别加入试剂盒提供的RNA Binding Buffer（10×）、RNase Inhibitor及对应抗体（m6A抗体4 μL或IgG抗体2 μL），补足DEPC水至100 μL体系，4℃孵育4小时（或过夜）。

（四）Protein A/G磁珠结合：加入20 μL Protein A/G磁珠，4℃混匀孵育2小时后置磁架分离。加入200 μL Wash Buffer轻轻吹打混匀，在4℃洗涤5分钟；重复洗涤3次。

（五）RNA纯化与反转录：将免疫沉淀物加入1 mL Trizol裂解液，裂解15分钟后提取RNA。取回收RNA按比例配置反转录体系：5× PrimeScript Buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、Random 6 mers 0.5μL、RNA样品 7μL，37℃反应15分钟，85℃终止5秒。所得cDNA用于qPCR分析。

（六）qPCR检测：每10μL反应体系含Master Mix 5μL、Forward Primer 0.2μL、Reverse Primer 0.2μL、cDNA 2μL、RNase-free水补足至10μL。反应程序为：95℃ 5 min预变性，40循环（95℃ 10 s，60℃ 30 s），随后进行熔解曲线分析。

图1：试剂盒图片

四、实验结果

实验以293T细胞为模型检测HIF1A基因RNA的m6A修饰情况。qPCR结果显示，m6A抗体组样本Ct值明显低于IgG组，说明HIF1A mRNA存在显著m6A修饰。熔解曲线单峰表明扩增特异性良好，RNA片段化电泳结果显示片段主要分布在100–300 nt之间，符合MeRIP实验要求。

图2：MeRIP-qPCR柱状图

3：RNA片段化电泳图

五、实验总结与特点

本实验基于 Bio.ruqi RNA甲基化免疫共沉淀试剂盒（MeRIP Kit，RQM008-01/02/03），完成了从RNA片段化到m6A富集与检测的全流程操作。该试剂盒包含完整实验体系，包括m6A抗体、IgG对照抗体、Frag Buffer、Protein A/G磁珠、RNA Binding Buffer与Wash Buffer，可满足RNA甲基化免疫共沉淀实验各步骤需求。

实验结果稳定、重复性良好，检测灵敏度高，可用于低丰度RNA修饰分析。该方法适用于RNA甲基化研究、基因表达调控与转录后修饰机制研究、肿瘤与代谢疾病机制研究及RNA修饰位点筛查。

六、结论

通过RNA甲基化免疫共沉淀（MeRIP）方法，可有效检测目标RNA的m6A修饰水平。本实验验证了HIF1A基因RNA中存在明显m6A修饰，结果可靠且特异性强。使用Bio.ruqi MeRIP试剂盒可实现从RNA提取到甲基化检测的标准化流程，适用于科研人员开展RNA表观修饰研究。

本实验所得的RNA样本不仅可用于qPCR验证，还可用于高通量测序（MeRIP-seq）分析，以研究全转录组范围内RNA甲基化修饰的分布与功能。

如需获取详细操作说明书及完整试剂组成，可私信索取《RNA甲基化免疫共沉淀试剂盒（MeRIP Kit）说明书》。