一、实验目的：
利用5mC抗体结合并沉淀具有5mC修饰的RNA片段；qPCR检测验证目标基因5mC修饰情况及具体位点。
二、实验材料
主要试剂
试剂名称
厂家
货号
PMSF
Genstar
B111-01
磷酸酶抑制剂
Selleck
B15001
蛋白酶抑制剂
Selleck
B14001
反转录试剂盒
TAKARA
RR037A
Anti-5-methylcytosine (5-mC) 抗体
ABCAM
ab10805
Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) 鼠源RNase抑制剂
Yeasen
10603ES05
RNA甲基化免疫共沉淀试剂盒(Merip KIT)
Bio.ruqi
RQM008
qPCRmix
Yeasen
11202ES03
主要仪器及器材
仪器名称
厂家
货号
高速冷冻离心机
湘仪
TGL-16
PCR仪
BIO-RAD
PTC-100
DynaMag™-2磁力架
Thermo
12321D
荧光定量qpcr仪
Thermo Fisher Scientific
ViiA7
垂直混匀器
Kylin-Bell
BE-1100
三、蛋白与RNA信息
抗体信息：
Anti-5-methylcytosine (5-mC) 抗体
四、实验步骤
（一）RNA提取
1.样本前处理：收集1×10^7细胞后，用预冷的 1×PBS漂洗两次，1000 rpm 室温离心5 min，去上清；
2.向细胞中加入1 mL Trizol 裂解，吹打至完全看不到细胞团块，室温放置 5 min；
3.按1 mL Trizol 加入200 μL氯仿，盖好管盖（注意：此次一定要盖好盖子，避免震荡过程中液体渗出）。用手剧烈震荡15 s，室温放置3 min；
4.12000 g、4℃离心 15 min；
5.小心转移上清液（约500 μL）至新的1.5 mL无酶离心管中；
6.加入等体积异丙醇，室温静置10min；（若预期RNA量比较少，可加入适量糖原，并于-20℃或-80℃沉淀过夜；）
7.12000 g、4℃离心 10 min；弃掉上清，保留沉淀；
8.加入1 mL 75％乙醇，颠倒混匀；
9.7500 g、4℃离心 5 min；弃掉上清；
10.7500 g、4℃离心 30s，用10ul小枪头尽量吸掉残留的液体；
11.室温静置5~10min，晾干乙醇；（看到RNA变半透明即可）
12.加入适量RNase-free水溶解RNA,室温静置10min，令RNA可以充分溶解；
13.RNA冻存到-80℃冰箱备用。
（二）RNA片段化
1. RNA 样品中加入等体积的frag buffer,吹打混匀；
2. 94℃孵育6min；
3.用酚氯仿回收RNA;
4.配制1%琼脂糖凝胶检测RNA片段大小；
5.取2μL RNA样品作为Input样品-80℃保存备用；
6.取分别取20 μL RNA 样品作为m6A组及IGG组。
（三）免疫沉淀
1.5mC组及IgG组分别中加入4μg5mC抗体及IgG抗体，置于垂直混匀器 4℃孵育过夜（16h）。
(五)protein A/G 与抗体结合
1.取出protein A/G磁珠，并充分震荡混匀；m6A组及IgG组中分别加入20ul磁珠，垂直混匀器 4℃孵育2h；
2.把样本置于磁力架上，静置1min，吸除上清；
3.向EP管中加入200ul洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀；并于垂直混匀器4℃洗涤 5 min；
4.把样本置于磁力架上，静置1min，吸除上清；
5.重复3与4步骤3次。
(六)RNA纯化回收
1.input、m6A、IgG样本分别1 mL Trizol裂解液；
2.吹打混匀并置于垂直混匀器4℃裂解15min；
3.按照（一）步骤，纯化回收RNA;
(六)RNA反转录
1. 按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
试剂组分
使用量
终浓度
5×PrimeScript Buffer（for Real Time）
2uL
1×
PrimeScript RT Enzyme Mix I
0.5uL
Random 6 mers（100μM）*1
0.5uL
50pmol
RNA
7uL
注意：注意反转录步骤RNA投入量按等体积进行，后续实验稀释及上机检测皆按比例进行。
2.按如下程序进行反转录：
37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！
3．定量PCR检测
1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
2） 冰上配制下表中的反应液
成分
加入量
终浓度
Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (lowRox)
5μL
1×
ForwardPrimer (10μM)
0.2μL
0.2μM
ReversePrimer (10μM)
0.2μL
0.2μM
cDNA
2μL
RNase-free Water
to10μL
3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
4）采用三步法程序进行反应：
循环数
步骤
温度
时间
荧光采集
1
预变性
95℃
5min
No
40
变性
95℃
10s
No
退火
60℃
30s
Yes
上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析
5．实验结果
qPCR检测结果(详细数据见附件excel”5mC RIP分析结果”)
5mC RIP-qPCR柱状图:
RNA片段化图：
